Stała ekspozycja mieści się w domu rodzinnym Jana Matejki (1838-1893) najwybitniejszego polskiego malarza nurtu historyzmu, kolekcjonera, miłośnika zabytków w szczególności Krakowa. Stara, krakowska kamienica (przebudowywana w XVIII i XIX w.) jest miejscem, w którym urodził się, mieszkał z rodziną, tworzył i zmarł Jan Matejko. Po śmierci artysty zawiązało się Towarzystwo jego imienia, które postawiło sobie za cel uczczenie osoby wybitnego malarza tworząc muzeum biograficzne jemu poświęcone. Dużym nakładem sił, w wykupionym od rodziny domu zgromadzono drogą systematycznych zakupów i darów różnorodne eksponaty związane z postacią Jana Matejki i jego rodziny, prezentując je po raz pierwszy publiczności już w 1898 roku. W 1904 r. Towarzystwo im. Jana Matejki przekazało utworzone przez siebie muzeum biograficzne pod zarząd Muzeum Narodowego w Krakowie. Dziś zbiory Domu Jana Matejki liczą około 6000 eksponatów.

Znajdują się w nich przedmioty codziennego użytku i pamiątki po artyście i jego najbliższych: żonie Teodorze z Giebułtowskich Matejkowej (1846-1896), dzieciach: Tadeuszu (1865-1911), Helenie Unierzyskiej (1867-1932), Beacie Kirchmayerowej (1869-1926), Jerzym (1873-1827) i Reginie (1878-1878). Zbiory obejmują listy, oficjalne dokumenty, pamiątki jubileuszowe, wyrazy uznania, a przede wszystkim prace olejne i rysunkowe, obiekty z kolekcji Matejki, którą gromadził przez całe życie, dzieła innych twórców, fotografie rodzinne oraz wykonane w XIX wieku fotografie obrazów mistrza oraz należący do niego zbiór książek i nut.

Dom Jana Matejki popularyzuje nieznane aspekty życia i twórczości artysty, jak również jego bogate zbiory rzemiosła, tkanin i militariów. Służą temu: stała ekspozycja, która prezentuje zbiory działu Muzeum Dom Jana Matejki, a także liczne wystawy czasowe w samym oddziale jak również na terenie całej Polski dzięki współpracy z licznymi ośrodkami muzealnymi z kraju i zagranicy.

Na terenie oddziału prowadzona jest także działalność edukacyjno-oświatowa: lekcje muzealne, warsztaty plastyczne dla dzieci oraz cykl wykładów Czwartki u Matejków.

Zbiory Jana Matejki zawierają eksponaty, które wiążą się z osobą artysty i jego twórczością. W dużej części jest to kolekcja rzemiosła artystycznego, tkanin, broni i zbiorów etnograficznych, którą artysta gromadził przez całe życie.